Новости

May 12, 2023

Картирование олигонуклеотидов с помощью масс-спектрометрии для комплексной характеристики первичной структуры мРНК-вакцины против атипичной пневмонии

Научные отчеты, том 13,

Научные отчеты, том 13, Номер статьи: 9038 (2023) Цитировать эту статью

364 доступа

55 Альтметрика

Подробности о метриках

Картирование олигонуклеотидов с помощью жидкостной хроматографии с УФ-детектированием в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (ЖХ-УФ-МС/МС) было недавно разработано для поддержки разработки Comirnaty, первой в мире коммерческой мРНК-вакцины, которая иммунизирует против вируса SARS-CoV-2. Аналогично пептидному картированию терапевтических белков, описанное здесь картирование олигонуклеотидов обеспечивает прямую характеристику первичной структуры мРНК посредством ферментативного расщепления, точного определения массы и оптимизированной фрагментации, индуцированной столкновениями. Подготовка проб для картирования олигонуклеотидов представляет собой быстрое расщепление одним ферментом в одной емкости. Гидролизат анализируют с помощью ЖХ-МС/МС с расширенным градиентом, а для анализа полученных данных используют полуавтоматическое программное обеспечение. Показания картирования олигонуклеотидов в рамках одного метода включают в себя высоковоспроизводимую и полностью аннотированную УФ-хроматограмму со 100% максимальным охватом последовательности, а также оценку микрогетерогенности по 5'-концевому кэпированию и длине 3'-концевого поли(А)-хвоста. Картирование олигонуклеотидов имело решающее значение для обеспечения качества, безопасности и эффективности мРНК-вакцин, обеспечивая: подтверждение идентичности конструкции и первичной структуры, а также оценку сопоставимости продуктов после изменений производственного процесса. В более широком смысле этот метод можно использовать для непосредственного изучения первичной структуры молекул РНК в целом.

Две вакцины с информационной РНК (мРНК), Comirnaty от Pfizer-BioNTech и Spikevax от Moderna, были одобрены FDA, EMA и другими регулирующими органами по всему миру для борьбы с пандемией коронавирусного заболевания 2019 года (COVID-19)1,2. COVID-19 вызван инфекцией тяжелого острого респираторного синдрома, вызванного коронавирусом-2 (SARS-CoV-2)3. мРНК-вакцины можно использовать для иммунизации, поскольку они содержат генетические инструкции для самотрансляции целевого иммуногенного белка4. мРНК в одобренных вакцинах против COVID-19 кодирует белок S-2P5, который отличается от белка-шипа SARS-CoV-2 двумя стабилизирующими мутациями пролина, которые порождают префузионную конформацию6. Лекарственное вещество (DS) мРНК производится путем транскрипции in vitro ( IVT) с использованием полимеразы бактериофага Т7 с N1-метил псевдоуридином, образующим модифицированную нуклеозидами информационную РНК (модРНК). modRNA DS впоследствии инкапсулируется липидными наночастицами (ЛНЧ) для доставки в клетки и защиты от деградационных сил. Составленные модРНК-ЛНЧ содержат лекарственный продукт (ДП), который вводят для вакцинации.

Производители лекарств несут безоговорочную ответственность за характеристику и понимание молекулярной структуры, последовательности, гетерогенности и примесей готовых лекарств и вакцин, которые они продают. Общая первичная структура мРНК DS, от 5'-конца до 3'-конца, следующая: 5'-кэп, 5'-нетранслируемая область (UTR), антиген-кодирующая область, 3'-UTR и 3'-полиаденозиновый хвост (поли(А) -хвост)7 в одноцепочечном формате. Чтобы быть компетентной к трансляции, мРНК должна быть кэпирована на своем 5'-конце8 и иметь поли(А)-хвост с достаточным количеством последовательных аденозиновых нуклеотидов9. 5'-кэп часто представляет собой 5'-концевой N7-метилированный гуанозинтрифосфат, соединенный с 5'-углеродом рибозы следующего аденозинового или гуанозинового нуклеотида, который также может быть метоксилирован по его 2'-углероду10. Эти атрибуты 5'-кэпа и поли(А)-хвоста также придают стабильность, защищая мРНК от процессов клеточной деградации11,12. Целостность полноразмерной первичной структуры мРНК, включая 5'-кэп и поли(А)-хвост, представляет собой важнейший показатель качества вакцинных БАД, который тщательно контролируется для обеспечения желаемого качества продукта.

За последние десятилетия были разработаны многочисленные хроматографические и электрофоретические методы «картирования олигонуклеотидов»13,14,15. Совсем недавно были разработаны методы характеристики мРНК на основе масс-спектрометрии (МС) с использованием ионно-парной обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (IP RP-HPLC-MS) для углубленной характеристики 5' Cap16 мРНК вакцин. и 3'-Поли(А)-хвост17. Однако они требуют очистки и специальных аналитических методов для характеристики каждого конца. Недавно были разработаны дополнительные аналитические методы, использующие ферментативное расщепление и IP-RP-ВЭЖХ с тандемным МС (МС/МС) и без него для секвенирования олигонуклеотидов больших РНК18,19,20,21,22. Различные ферменты в растворе22 или иммобилизованная РНКаза Т1 на магнитных частицах были оценены на предмет улучшения покрытия последовательности. Накаяма и др. разработали метод профилирования мРНК на основе ЖХ-МС с использованием стандартов, меченных стабильными изотопами. Несмотря на новаторскую работу по характеристике первичной структуры РНК, обсуждавшуюся ранее18,19,20,21,22, для этой области полезно иметь аналитический метод, который является одновременно всеобъемлющим и простым в использовании. Идеальная олигонуклеотидная карта, подходящая для простой реализации, - это карта, способная напрямую и эффективно охарактеризовать всю длину РНК, включая 5'-Кэп и 3'-концевую гетерогенность, в одном сосуде, с помощью одного фермента, не требующего мечения стабильным изотопом. элементы управления. Он разделяет изомеры последовательностей и создает полностью аннотированную УФ-хроматограмму с картой максимального покрытия последовательностей.